Действие сверхмалых доз биологически активных веществ и низкоинтенсивных физических факторов

Е.Б.Бурлакова, А.А.Конрадов, Е.Л.Мальцева

Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля

Аннотация
В данной работе подводятся итоги длительного этапа исследований реакции живых систем на сверхслабые воздействия. Следует заметить, что становление этого нового направления в науке о живых системах было непростым – от полного отрицания самого наличия проблемы и достоверности экспериментальных данных до осознания ее как единого явления. К настоящему времени имеются многочисленные экспериментальные данные, классифицированные авторами работы по видам воздействия. Рассмотены результаты влияния ультранизких концентраций рахличных биологически активных веществ и ультраслабых физических полей (в основном электромагнитных) на биологические системы разного уровня организации – от молекулярного до популяционного. Для всех систем показано существование ряда однотипных эакономерностей: полимодальных дозовых зависимостей, эффективности при уровнях воздействия ниже фоновых значений и ее зависимость от состояния системы, модификация чувствительности системы к последующим (другим) воздействиям и др. Приводится ряд гипотех о возможных механизмах являения, о роли воды в этиих процессах как универсального посредника. Обсуждены возможные последствия и практические применения явления. Статья содержит большой библиографический материал и сводные таблицы результатов.

Анализ результатов исследований по эффекту сверхмалых доз биологически активных веществ (БАВ)
В 1983 г. сотрудники нашего института вместе с коллегами из Института психологии, изучая влияние антиоксидантов на электрическую активность изолированного нейрона виноградной улитки, поучили весьма неожиданный результат. Первоначальная доза препарата (10-3 М)была для нейрона не только активной, но и довольно токсичной, поэтому пришлось перейти на менее концентрированный раствор. К нашему удивлению, доза на четыре порядка ниже первоначальной оказалась не только менее токсичной, но и более эффективной. Ее дальнейшее уменьшение приводило к росту эффекта, он достигал максимума (при 10-15 М), затем снижался, пока результаты (при 10-17 М) практически не совпадали с контрольными. Аналогичные закономерности впоследствии были зарегистрированы в экспериментах на животных при введении им антиоксиданта и изучении чувствительности холинорецептора к действию холиномиметика ареколина.

Мы исследовали эти эффекты на животных и растительных клетках, на организменном уровне, уровне биомакромолекул и т.д. Изучалось действие противоопухолевых и антиметастатических веществ, радиозащитных препаратов, ингибиторов и стимуляторов роста растений, нейротропных препаратов разных классов, гормонов, адаптоге-нов, иммуномодуляторов, детоксицирующих агентов, антиоксидантов, физических факторов - ионизирующего облучения и др. Десятилетний опыт работы (1983-1993) привел нас к мысли о том, что мы имеем дело не с особенностью действия како-го-то одного препарата или ответа одного какого-то биологического объекта, а с некими принципиально новыми закономерностями взаимодействие биологических объектов со сверхмалыми дозами (сверхмалыми дозами мы считаем концентрации БАВ 10-13–10-15 М и ниже). При таких концентрациях на одну клетку приходится десять и меньше молекул БАВ. Каждое из этих веществ может обладать специфической мишенью, своим механизмом усиления, особенностями метаболизма, однако при сверхнизких дозах они демонстрируют и ряд общих закономерностей. Как выяснилось позже, и физические факторы низкой интенсивности проявляют аналогичные закономерности.

Уровень биологической организации, на котором обнаружено действие сверхмалых доз БАВ, тоже весьма разнообразен –от клетки, макромолекул, органов и тканей до животных, растительных организмов и даже популяций. Сказанное не означает, что эффект наблюдался при сверхмалых дозах любого БАВ на любом биологическом объекте. Мы лишь хотим подчеркнуть, что получение эффекта от действия БАВ в концентрациях 10-13 – 10-17 М и ниже нельзя связать с какой-то определенной структурой вещества или ступенью биологической организации .

Зависимость "доза-эффект" для биологически активных веществ
Общие закономерности влияния сверхмалых доз препаратов наиболее ярко проявляются при изучении дозовых зависимостей. В некоторых случаях эта зависимость бимодальная: эффект возрастает при сверхмалых дозах препаратов, затем по мере увеличения дозы уменьшается, сменяется так называемой мертвой зоной, где он не заметен, и вновь усиливается. Иногда в дозовой зависимости обнаруживается стадия "перемены знака" эффекта. Например, если в области сверхнизких доз отмечалась ингибирующая активность, то по мере роста концентрации она сменялась стимулирующей, а затем вновь ингибирующей. Известны случаи, когда эффект в очень большом диапазоне концентраций не зависел от дозы. Мы исследовали действие гербицида из класса гидропероксидов на растительную культуру клеток. Препарат проявлял одинаковую активность при дозах, различающихся на шесть порядков: 1 (H3 –10-7 М).

В диапазоне концентраций между этими дозами эффект отсутствовал. Два максимума стимулирующего действия на рост растительных клеток имеют на кривой дозовой зависимости антиоксиданты. Эксперименты, поставленные в других лабораториях, подтвердили наши результаты. Так, И.Н.Топчиева с коллегами получили бифазную кривую для скорости синтеза антител селезенкой при введении мышам иммуногенного полимера. Равная (близкая) активность приходилась на дозы полимера, различавшиеся на пять порядков в области концентраций между этими максимальными значениями полимер практически не проявлял активность]. А.Робертсон и И.Гратч изучали число колхициновых митозов в зависимости от концентрации нуклеотида в среде. Максимумы эффекта зарегистрированы при концентрации 5 х 10-11 и 10-6М. В промежутке между этими дозами эффект был существенно ниже. С.В.Зайцев с сотрудниками выявили активность энкефалина при концентрации 10-14М. "Респираторный взрыв" ингибировался при дозах 10-14 – 10-11 М, но при промежуточных значениях доз ингибирование отсутствовало.

В обзоре Дж.Дэвиса и Д.Свенсгарда приведены многочисленные экспериментальные и клинические сведения об U-образных кривых зависимостей "доза-эффект", полученных на различных животных и человеке при действии токсичных агентов –таких, например, как свинец или алкоголь. Во всех случаях эффект был ярко выражен при низких дозах препаратов, затем он уменьшался по мере увеличения дозы, возвращался к норме, потом менял знак на противоположный.

Мы уже говорили, что аномальная дозовая зависимость для сверхнизких концентраций БАВ зарегистрирована на уровне ответа не только клетки или целостного организма, но и отдельных биомакромолекул. На изолированном ферменте - протеинкиназе-С, выделенной из сердца животных, – изучалась ингибирующая активность токоферола. Протеинкиназа-С – сложный, липидзависимый, кальцийтребующий фермент, который имеет несколько активных центров, аллостерически взаимодействующих друг с другом. В литературе приводились данные о том, что в области концентраций 10-4 – 10-5 М токоферол оказывает ингибирующее действие на активность протеинкиназы-С. Наши исследования ингибирующего эффекта токоферола в широком интервале концентраций (10-18 – 10-5 М) показали, что существует бимодальная зависимость эффекта от дозы. Токоферол активно ингибирует протеинкиназу-С при концентрациях 10-16 – 10-12 М и 10-4 – 10-5 М. В промежуточном интервале концентраций активность его существенно ниже. Аналогичные данные получены и для протеинкиназы-С, предварительно активированной форболовым эфиром. Ингибирующая активность такого фермента при низких концентрациях токоферола была меньше, чем у неактивированного, и максимум ее приходился на более высокие концентрации токоферола, однако бимодальный характер зависимости сохранялся.

Чувствительность биологических объектов к сверхмалым дозам
Влияние сверхмалых доз БАВ или низкоинтенсивного облучения проявляется не только в аномальной зависимости от дозы (хотя этот факт особенно привлекателен для практики), но и в других эффектах – прежде всего модификации чувствительности биологических объектов к широкому спектру эндогенных и экзогенных воздействий. Так, после низкоинтенсивного облучения изменяются не только физико-химические, биофизические, биохимические характеристики клеток облученных животных, но и физиологические параметры. Например, у животных, испытывающих действие очень низких доз ионизирующей радиации, изменяется чувствительность центральной нервной системы к действию холиномиметиков, а у клеток, получивших такую же дозу, – чувствительность к последующему облучению.

В экспериментах с растениями мы изучали активность гербицидов. Растения обрабатывались двумя препаратами, производными 2-хлор-феноксиуксусной кислоты. Один вводился в дозе 10-11 – 10-13 М, другой – 10-18М. Эффективность каждого из них в отдельности не превышала 1%, и ожидаемый аддитивный эффект был равен 2%. В действительности же при введении обоих препаратов мы наблюдали 100-процентное ингибирование роста растений. Аналогичные данные получены ранее Б. Бонавидом с сотрудниками. При совместном введении в низких дозах фактора некроза опухолей и адриабластина у животных наблюдался высокий синергический эффект.

Наше объяснение этих данных допускает, что сверхмалые дозы препаратов влияют на чувствительность клеток и организмов к последующему действию других биологически активных веществ или повреждающих факторов. Чувствительность может возрастать, и тогда мы имеем синергический эффект, либо уменьшаться, и тогда проявляется защитное действие препаратов. Мы предположили, что по тому же каналу, по которому действуют малые дозы низкоинтенсивного облучения, могли бы оказывать влияние и радиозащитные препараты, если их ввести в сверхнизких концентрациях. И действительно, зафиксировано радиозащитное действие антиоксидантов в дозах 10-15 М при низкоинтенсивном ионизирующем облучении. Эти же препараты в тех же дозах проявляли защитный эффект и от химических отравляющих веществ.

С аналогичных позиций можно объяснить наблюдавшееся Н.П.Коноваловой с сотрудниками антиметастатическое действие препаратов лоди-намина и эфазола, вводимых в дозах 10-15 - 10-17 М. На моделях меланомы В-16 и рака Льюиса обнаружено практически полное подавление метаста-зирования. При этом эффект для доз эфазола 10-15 - 10-17 М сопоставим с его действием в дозах 10-2 - 10-14 M.

Ответ биологических объектов на введение сверхмалых доз БАВ обладает еще одной важной особенностью – гетерогенностью, определяемой начальными биохимическими, биофизическими, физиологическими и другими характеристиками. А.Н.Голощапов с сотрудниками установили, что антиоксиданты фенозан и анфен в дозах 10-14 М оказывают различное воздействие на антиокислительную активность мембран лимфоцитов. У лимфоцитов с высоким уровнем перекисного окисления липидов наблюдается ингибирование этого процесса при введении препаратов, с низким – его индукция.

Возможные механизмы действия сверхмалых доз
Чтобы понять, как влияют сверхмалые дозы препаратов на биологические объекты, нужно в первую очередь объяснить с кинетической точки зрения саму возможность реакций столь малого числа молекул со своими мишенями. При концентрациях 10-15 М и ниже перестает работать закон действующих масс Вант-Гоффа и в определенной степени теряется понятие "концентрация". В работе Л.Блюменфельда, А.Гросберга и А.Тихонова приводится уравнение, описывающее реакцию между молекулами и малыми, но макроскопически замкнутыми везикулами с позиции статистической физики. Показано, что закон действующих масс нарушается, когда объем везикул и (или) константа равновесия реакции достаточно малы, а среднее число свободных частиц внутри везикулы порядка единицы или меньше. Важное значение приобретают флуктуации, особенно для биологических везикул, размер которых 102 – 103 А.

Некоторые специалисты обращают внимание на кинетические парадоксы, связанные с тем, что многие биологически активные вещества действуют в дозах на несколько порядков более низких, чем константы диссоциации их комплексов с рецепторами. И.П.Ашмарин с сотрудниками исследовали действие 14 нейропептидов, четыре из которых оказались активными в дозах10-16 – 10-14М. В то же время известные константы диссоциации комплексов нейропептидов с их рецепторами равны 10-12 – 10-18М.

Аналогичные закономерности обнаружены и нами при изучении биологического действия антиоксидантов. Константы специфического связывания их белками равны 10-8 – 10-9М, между тем активность антиоксидантов проявляется уже при концентрациях 10-15 – 10-18М. Самое простое объяснение этого парадокса – допущение существования рецепторов, имеющих более низкие константы диссоциации их комплексов с биологически активными веществами, но мы их не можем обнаружить с помощью современных методов исследования.

Однако С.В.Зайцев и Л.А.Сазанов предложили другое оригинальное объяснение. Они использовали модель клеточной адаптации, разработанную Д.Кошландом для описания хемотаксиса бактерий в ответ на действие аттрактантов (репелентов). Согласно этой модели, бактерии "отвечают" не на концентрацию аттрактанта как таковую, а на разность концентраций, их градиент в двух близлежащих точках на пути своего движения. Увеличение (уменьшение) концентрации порождает быстрый ответ, который затухает (возвращается к начальному уровню) за более длительный период, чем время его возникновения.

С.В.Зайцев и Л.А.Сазанов модифицировали эту модель, чтобы объяснить кинетические парадоксы действия сверхмалых доз. Они предположили существование нескольких (в простейшем случае - двух) рецепторов или ферментов, с которыми связывается лиганд. Рецепторы имеют различные константы перехода из начального состояния в активное (и обратно) и действуют в противоположных направлениях. Производя расчеты скорости проявления общего эффекта как разности эффектов, вызванных связыванием сверхмалых доз вещества на разных рецепторах, исследователи показали возможность существования бимодальной зависимости с максимумом для сверхмалых доз БАВ. Характер ответа зависит от времени наблюдения, различий в константах диссоциации комплексов и др.

С помощью этой модели удается объяснить и большую "удаленность" действующих концентраций от констант диссоциации комплексов "лиганд-рецептор", и возможность почувствовать влияние введенного препарата в концентрациях, на порядки ниже эндогенных.

Мы предложили другой подход к объяснению кинетических парадоксов. В основу его положено представление об аллостерическом взаимодействии каталитических центров в молекуле фермента. Допустим, что фермент или рецептор содержат несколько центров с разным сродством к субстрату, например, константы диссоциации для одного центра 10-13 М, а для другого – 10-8 М. Когда вводятся низкие дозы препарата, молекулы преимущественно связываются с высокоаффинным центром. При увеличении дозы в "игру" вступает второй центр. Он взаимодействует аллостерически с первым, понижая его сродство к субстрату, и тогда все молекулы, которые были связаны с первым центром, "сходят" с него. Вновь с ним связаться они могут после того, как концентрация препарата приблизится к значению константы диссоциации комплекса "ли-ганда" с первым центром, достигнутому под воздействием второго. Такое представление используется, в частности, для объяснения сложного ответа обонятельного рецептора на изменение дозы субстрата.

Л.А.Блюменфельд выдвинул идею о параметрическом резонансе как возможном механизме действия сверхнизких концентраций биологически активных веществ на клеточном и субклеточном уровнях. Он полагает, что параметрический резонанс возникает при совпадении временных параметров запускаемых БАВ внутриклеточных процессов и характерного времени подхода БАВ к мишени. В результате связывания БАВ с его мишенью фермент (рецептор) переходит в конформационно-неравновесное состояние, которое на определенной стадии релаксации обеспечивает его максимальную активность.

При очень больших концентрациях БАВ, когда характерное время подхода к мишени мало, а частота подхода велика, весь фермент будет находиться в малоактивном конечном равновесном состоянии. При очень малой концентрации, когда характерное время подхода БАВ к мишени очень велико, почти весь фермент (рецептор) останется в малоактивном исходном равновесном состоянии. И только для доз БАВ, при которых характерное время подхода БАВ к своей мишени и временные параметры запускаемых им внутриклеточных процессов практически совпадают, можно ожидать максимальной стационарной концентрации промежуточной активной неравновесной конформации.

Расчеты показывают, что пик активности приходится на дозы 10-11 – 10-15 M. Для близких более высоких или низких концентраций активность будет существенно ниже. Равная или более высокая достигается лишь при увеличении концентрации до 10-5 – 10-4М, когда активность изменяется уже по другому механизму в связи с насыщением центров ферментов (рецепторов) лигандами. С точки зрения этих представлений, БАВ может взаимодействовать со своими мишенями, даже если константа диссоциации комплекса "БАВ-мишень" будет существенно (на порядки) выше, чем применяемые концентрации. Находит свое объяснение и уменьшение активности при возрастании дозы.

Рассматривая взаимодействие двух противоположно направленных процессов, например, повреждения и репарации, специфической активности и токсичности, удается объяснить и бимодальный характер дозовой зависимости. Предположим, что при малых дозах облучения системы восстановления не индуцируются или индуцируются не в полной мере, в результате чего мы наблюдаем лишь эффекты, связанные с повреждением биомолекул. По мере возрастания дозы облучения процессы восстановления активируются и могут полностью "нейтрализовать" повреждающие. Именно тогда будет наблюдаться "мертвая зона" в зависимости "доза-эффект". Превалирование процессов восстановления над повреждением приводит к эффекту гормезиса.

В дальнейшем по мере повышения дозы облучения отношение повреждение/восстановление увеличивается и эффект растет линейно или квадратично-линейно от дозы. Таким образом, количественные математические и качественные феноменологические модели позволяют объяснить закономерности действия сверхмалых доз, одна ко необходима серьезная экспериментальная проверка этих моделей.

Универсальность механизма ответа биологических объектов на действие сверхмалых доз БАВ и физических факторов низкой интенсивности не получила однозначной трактовки. Одни исследователи считают, что наличие общих закономерностей в зависимости "доза-эффект", изменение чувствительности биологических объектов к широкому спектру разнообразных факторов (внутренних и внешних), гетерогенность ответа как результат введения сверхмалых доз свидетельствуют лишь о внешнем сходстве явлений. В каждом конкретном случае рекомендуется искать свой механизм, свои мишени действия, свои возможности усиления сигнала и т.д.

Другие, не отрицая специфичности реакции в каждом конкретном случае, развивают представления об общем характере ответа биологических объектов на сверхмалые дозы БАВ, о системном изменении метаболизма под влиянием сигналов из внешней среды.

Мы придерживаемся второй точки зрения.

Источник: статья " Действие сверхмалых доз... " (Вестник РАН, 1994, том 64, М5, с. 425-431)